从CAR-NK细胞疗法的案例中看细胞免疫疗法的走向

　　CAR-T细胞疗法:优点和局限性

　　修饰以表达嵌合抗原受体 (CAR) 的 T 细胞代表了细胞治疗和个性化医疗领域的重大进步。在该策略中，患者自身的 T 细胞被分离并经过改造以表达与肿瘤抗原结合的合成受体诱导肿瘤细胞死亡。然后将这些 CAR 工程化的 T 细胞在体外扩增至具有临床意义的数量，并作为癌症免疫疗法输回患者体内。这些工程细胞的效力在于将 T 淋巴细胞的效应子功能与抗体的特异性和结合亲和力相结合。CAR 的胞外域包含一个抗原结合单链可变片段，该片段由抗体的可变重链和可变轻链组成，通过短肽接头融合。胞内域由信号分子组成，传统上来自于T 细胞受体 (TCR) CD3ζ 链和其他(可选)特征，取决于CAR构建体的生成。

　　CAR-T细胞首次尝试以CD19作为靶抗原对抗B 胞恶性肿瘤，在多次复发和化疗难治的疾病中产生显着的临床反应。尽管这种疗法很优雅且临床上取得了成功，但自体CAR-T细胞仍有一些局限性。

　　首先，从临床角度来看，并非所有患者都适合这种疗法。例如，一些癌症患者接受了大量的预处理，并有显着的T细胞淋巴细胞减少症，这可能会阻碍收集足够数量的自体T细胞来获得临床相关剂量的CAR-T细胞。

　　此外，产生自体 T 细胞的过程CAR-T细胞产品冗长，物流繁琐;因此，疾病快速进展的患者通常不适合这种疗法。CAR-T 细胞的另一个局限性是它们的毒性特征，因为临床经验表明，接受这种疗法的患者存在细胞因子释放综合征 (CRS) 和免疫效应细胞相关神经毒性综合征 (ICANS) 的巨大风险，尤其是那些体积庞大的肿瘤。

　　幸运的是，这些炎症综合征的共识分级和管理指南的进展显着改善了 CAR-T 细胞相关毒性患者的预后。CAR-T 细胞治疗后靶抗原丢失可能会导致另一个临床问题，因为 CAR-T 细胞的杀伤取决于CAR的参与;也就是说，靶抗原丢失使这些免疫细胞失效。

　　最后，同种异体 CAR-T 细胞正在探索用于现成治疗，但考虑到它们与移植物抗宿主病 (GVHD) 相关的风险，同种异体 CAR-T 细胞需要进一步的基因改造，例如删除 TCR，以降低这种风险。

　　临床案例

　　一名 46 岁的女性之前没有任何医疗问题，主诉颈部肿胀和喉咙受压，就诊于她的初级保健医生。她否认任何发烧、盗汗或体重减轻的病史。体格检查发现她的颈部和腹股沟区域有可触及的淋巴结。

　　颈部、胸部、腹部和骨盆的计算机断层扫描显示横膈膜上方和下方弥漫性淋巴结肿大。实验室值显示血红蛋白为 11 g/dL，乳酸脱氢酶为 431 U/L。左侧腹股沟淋巴结切除活检和骨髓活检证实了 3 级、IV 期滤泡性淋巴瘤伴骨髓受累的诊断。

　　滤泡性淋巴瘤国际预后指数评分为 4，表明为高危疾病。患者接受利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松化疗6个周期后，达到完全缓解。四年后，她复发并接受了多线治疗，包括利妥昔单抗、奥比妥珠单抗加苯达莫司汀，以及利妥昔单抗、吉西他滨和奥沙利铂。

　　治疗无效，疾病变得难治，患者进入白血病期，白细胞增多(白细胞>200×103/μL，淋巴细胞 90%)。正电子发射断层扫描 - 计算机断层扫描显示膈肌上下多个淋巴结的氟脱氧葡萄糖摄取增加(高达 14 的标准化摄取值)，并伴有巨大的腹部淋巴结肿大。腹股沟淋巴结活检显示滤泡性淋巴瘤 2 级(90%)和 3A 级(10%)。

　　骨髓活检显示滤泡性淋巴瘤广泛受累，流式细胞术显示异常的 λ 限制性 B 细胞群 CD19、CD20、CD22、CD38 暗淡和 CD10 暗淡，CD5、CD43 和 CD200 阴性。该患者接受了超分割环磷酰胺加地塞米松治疗并获得了部分缓解，尽管持续的巨大腹部淋巴结仍然明显。

　　考虑到她的疾病已处于晚期，无法接受多种疗法，而滤泡性淋巴瘤的白血病期预示着预后不佳，我们的患者被考虑接受自体 CAR-T 细胞疗法治疗。

　　然而，她不是这种疗法的候选人，因为Yescarta和 Kymriah仅被批准用于已转化为高级别淋巴瘤的滤泡性淋巴瘤，即使该疾病确实符合转化标准，患者的严重 T 细胞淋巴细胞减少症和快速进展疾病不允许收集自体 T 细胞和必要的等待制造自体 CAR-T 细胞产品。

　　接下来，该患者被考虑进行同种异体 CAR-T 细胞疗法的临床试验，但鉴于针对与供体不匹配的 HLA 等位基因的多种抗体，该患者不符合条件。此外，我们的患者患有大块腹部疾病，这会导致使用 CAR-T 细胞疗法增加CRS和ICANS的风险。

　　NK细胞作为CAR工程的替代平台

　　鉴于 CAR-T 细胞疗法的上述局限性以及患者特定的临床和疾病相关特征，决定采用可能规避这些问题的 CAR 自然杀伤 (NK) 细胞的替代方法。

　　NK 细胞是CD3-CD56+先天淋巴细胞，在宿主防御传染性病原体和恶性肿瘤方面发挥着重要作用。与 T 细胞不同，NK 细胞可以杀死转化细胞，而无需事先抗原引发，并且它们的杀伤能力不受限制主要组织相容性复合物 (MHC) 分子的靶细胞表达。

　　事实上，NK细胞活性受激活和抑制受体的广泛库控制(图 1)，其正负信号的复杂整合决定了NK细胞的最终处置杀死或不杀死靶细胞。因此，NK细胞能够区分正常细胞和“应激”细胞。

　　健康细胞可以幸免于难，因为它们表达与 NK 细胞上的抑制性受体结合的自身 MHC I 类分子，从而传递“无杀伤”信号，而转化或感染的细胞会下调 MHC I 类分子或上调应激诱导的分子，例如MICA/MICB 和 ULBP 与激活受体(如 NKG2D)结合，将激活信号传递给 NK 细胞以进行杀伤。因此，通过下调 MHC I 类逃避 T 细胞杀伤的肿瘤细胞仍然容易受到杀伤 NK 细胞的影响。

　　与 T 细胞相比，NK 细胞的另一个主要优势是它们在同种异体环境中不会引起 GVHD，使其成为第三方现成细胞疗法的安全选择。同种异体 NK 细胞也不太容易被受体同种异体反应性 T 细胞排斥。许多临床前研究表明，移植物中的 NK 细胞可以靶向并杀死可能参与排斥供体细胞的宿主淋巴造血细胞。

　　事实上，我们的临床数据证实了过继转移的CAR-NK细胞在尽管 HLA不匹配，但患者至少一年，支持 NK 细胞可能不太容易受到宿主抗移植排斥反应的观点。因此，NK细胞在GVHD和宿主抗移植反应方面的这些有利特征可能会避免同种异体环境中的HLA匹配。

　　图 1 激活和抑制受体的NK细胞库

　　尽管具有优势，但NK细胞有许多可能会影响其功效的局限性。这些包括在没有细胞因子支持的情况下只有1到2周的短寿命、有限的细胞数量通常需要离体扩增和激活，以及与其他免疫细胞一样，对免疫抑制性肿瘤微环境的易感性可能反过来限制它们的运输和效应器功能。工程学的进步使研究人员能够克服其中的一些限制。例如，在NK细胞中加入细胞因子转基因(例如，白介素[IL]-2或IL-15)可以增强它们的增殖和持久性，并且加入趋化因子受体可以促进它们向肿瘤部位的运输。其他工程策略改善NK细胞性能的方法在别处进行了综述。

　　鉴于其独特的生物学特征、强大的先天抗肿瘤活性以及在临床中良好的安全性，NK细胞在过去几年中作为CAR工程的新兴替代平台受到了相当多的关注。NK细胞的纯群体可以来自自体或同种异体来源，例如外周血;脐带血;干细胞，包括诱导多能干细胞和造血干细胞;和体外增殖的NK细胞系，例如 NK-92。

　　源自癌症患者的自体NK细胞的局限性，包括效应子功能降低和对患者特异性产品(类似于自体 T 细胞)的需求，导致同种异体NK细胞作为CAR工程的平台。用于CAR工程的同种异体NK细胞可以来自多种来源，每个来源都有独特的优势和局限性。脐带血是现成的同种异体 NK 细胞来源，虽然数量上很少，但由于其固有的高增殖能力，可以扩展到大的、高功能的剂量。

　　此外，在全球库存中获得数十万个脐带血单位允许选择对同种异体过敏没有交叉反应的单位患者，至于这里介绍的案例。另一方面，外周血 NK 细胞表型成熟且功能强大;然而，它们的使用需要一个愿意接受白细胞去除术或献血的健康捐献者。源自诱导性多能干细胞的 NK 细胞不成熟，抗体依赖性细胞毒性诱导 CD16 受体的表达较低，但具有高度增殖性，可随时用于生物库。

　　最后，NK 细胞系，如 NK- 92细胞可以很容易地扩增和操作，但由于它们来源于NK淋巴瘤患者未分化的NK细胞前体，它们缺乏CD16和一些杀伤性免疫球蛋白样受体的表达，并且由于它们的恶性潜能，它们在临床使用前需要放疗，这反过来又会限制它们的体内持久性和有效性。

　　大量临床前研究已经证实了来自这些来源的 CAR 工程化 NK 细胞在体外和体内对抗一系列癌症模型的活性。最近，正在探索 CAR-NK 细胞在不同恶性肿瘤中的功效(已完成或正在招募的临床研究正在总结于表 1)。

　　我们对复发性或难治性 B 细胞血液系统恶性肿瘤患者进行了 CAR-NK 细胞疗法的首次人体 1/2 期临床试验(ClinicalTrials.gov 编号 NCT03056339)。

　　NK细胞来自脐带血，并且是HLA与收件人不匹配。用于转导NK细胞的逆转录病毒载体编码了针对CD19抗原和 IL-15 的CAR，以增强 NK 细胞的持久性和功能。添加了一个诱导型半胱天冬酶9自杀基因 (iCas9) 作为安全开关。11名接受过严重预处理的患者以3个不同的剂量水平(1×105、1×106 或 1×107个细胞/公斤)接受了这种疗法。8人有反应，总体反应率为 73%，7 人完全缓解 (64%)。

　　这些反应是快速的，并且在所有剂量水平下都能看到。重要的是，任何患者均未出现包括 CRS、ICANS 或 GVHD 在内的严重毒性。根据这些数据，我们的患者正在考虑参与 CAR-NK 细胞研究。生产用于治疗癌症患者的现成脐带血 CAR-NK 细胞的最终目标示意图显示在视觉摘要的 A 组中。

　　表 1. 评估用于基于 CAR 的癌症治疗的替代免疫细胞的临床试验

　　其他免疫效应细胞作为CAR工程的载体

　　除了 NK 细胞之外的免疫效应器也正在研究作为 CAR 工程的替代平台。这些细胞群具有许多特定的生物学特征，可以显着扩展和多样化基于 CAR 的疗法。

　　例如，NK T 细胞作为可能的 CAR 载体受到越来越多的关注，因为它们具有先天性和适应性免疫细胞的特征。与先天免疫细胞非常相似，它们可以对抗原暴露产生快速反应，但它们也可以以适应性细胞的方式显示精确的抗原识别。与传统 T 细胞不同，它们的 TCR 识别由 CD1d 呈递的脂质抗原，CD1d 是一种单态 MHC 类1 样分子。

　　另一组被探索作为 CAR 工程潜在平台的免疫效应细胞是 γδ T 细胞。这些 T 细胞在上皮表面占主导地位并表达 γδ TCR，其以 MHC 非依赖性方式(例如，通过氨基双膦酸盐)触发，与 αβ TCR 激活相反。γδ T 细胞还可以将抗原交叉呈递给 αβ T 细胞和因此可以作为先天免疫和适应性免疫之间的联系。

　　细胞因子诱导的杀伤细胞 (CIK) 是一组具有混合 T 和 NK 细胞样表型的免疫效应细胞，因此可以在 MHC 依赖性和MHC 独立方式。探索 CAR 转导的 CIK 细胞的临床前研究报告了在血液学 和实体瘤设置中的有希望的结果，并导致正在进行的临床试验 (NCT03389035) 测试 CAR CIK 的安全性-患有复发性或难治性 B 细胞急性淋巴细胞白血病的成人和儿童患者的 CD19 细胞。

　　除了淋巴细胞，一种不同类型的免疫细胞具有能够穿透肿瘤床并自然吞噬恶性细胞、巨噬细胞的优势，作为基于 CAR 的疗法的可能效应物而受到关注。替代免疫的优缺点表 2 总结了用于基于 CAR 的癌症治疗的效应细胞。作为 CAR 平台的这些类型免疫细胞的临床前评估支持这一预测，并且正在计划或正在进行使用这些细胞类型的临床试验(见表格1)。

　　表 2. 替代免疫效应细胞作为 CAR 工程平台的优缺点

　　CRISPR介导的基因编辑成为细胞疗法的下一个前沿

　　适应真核基因编辑的细菌和古细菌免疫系统会进一步提升细胞治疗领域吗?基因组编辑技术允许研究人员通过添加、移除或以其他方式改变 DNA 来修改基因组。已经设计了几种方法，包括锌指、转录激活因子样效应核酸酶，以及最近的成簇规则间隔短回文重复序列 (CRISPR) 系统。

　　CRISPR的发现彻底改变了基因编辑领域，因为它简单、高效、CRISPR-Cas系统是一种针对病毒(噬菌体)和质粒的 RNA介导的细菌防御系统，被重新用于哺乳动物细胞中精确的RNA 可编程基因组编辑。

　　简而言之，实验室中用于基因编辑的 CRISPR-Cas9 技术依赖于2个关键要素：Cas9 酶，它充当一把分子剪刀，在特定位点切割 DNA;和一段 RNA，称为向导 RNA，它由2个片段组成(反式激活 CRISPR RNA，它与 Cas9 酶结合，CRISPR RNA，一个18到20个核苷酸的序列，预先设计用于识别互补目标基因中的 DNA 靶位点)。

　　因此，向导 RNA 可以将 Cas9 酶引导至所需的基因编辑目标序列。CRISPR-Cas9 工具还可用于通过使用多个单向导 RNA 同时靶向多个基因。需要注意的是，通过使用工程化核酸酶技术(如CRISPR基因编辑)，可能会出现非特异性和非预期的基因修饰，如脱靶切割位点的插入或缺失。

　　对于临床应用，即使是低频改变的识别也将至关重要。因此，在基于CRISPR的疗法应用于临床之前，通过 GUIDE-Seq、 CIRCLE-Seq和rhampSeq等技术仔细评估脱靶效应是必不可少的。最近证明使用核糖核蛋白复合物和高保真 Cas9 可以显着减少这种不需要的 DNA 变化的发生。

　　鉴于这种基因编辑技术的多功能性，可以想象它在细胞治疗中的潜在应用。一个好的起点是通过选择性抑制细胞溶解活性的负调节因子和增加激活信号来改变免疫效应细胞的功能。该技术还可用于通过靶向与毒性相关的基因来微调细胞治疗产品的安全性。

　　Stadtmauer 等人最近报道了CRISPR 修饰的过继细胞治疗癌症的积极步骤。在人类先导研究中，研究人员从难治性癌症患者的血液中分离出自体 T 细胞，并用靶向TRAC、TRBC1和TRBC2的CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物对其进行电穿孔，以抑制内源性TCR和PDCD1，从而降低程序性细胞死亡蛋白 1 的表达。

　　然后用慢病毒载体转导细胞以表达对癌症 - 睾丸抗原 NY-ESO-1和LAGE-1具有特异性的 TCR，离体扩增，然后通过静脉输注返回给患者。这一阶段 1 研究确立多重CRISPR-Cas9介导的人类 T 细胞基因组工程的可行性和初步安全性。

　　其他评估 CRISPR 修饰过继细胞疗法的临床试验正在进行中，如表 3 所示。我们小组已经开发出一种将CAR工程与CRISPR-Cas9基因编辑在原代 NK 细胞中相结合的方法，我们正致力于开发一种良好的生产用于治疗癌症患者的现成 CRISPR 修饰脐带血CAR-NK细胞的生产实践合规策略(视觉摘要，B 组)。

　　表3 CRISPR-Cas 修饰的癌症细胞疗法

　　结论和未来展望

　　CAR-T细胞疗法已从本世纪初的一个令人兴奋的概念发展为具有治愈B细胞恶性肿瘤潜力的高效治疗方法。尽管如此，尽管CAR-T细胞与其他形式的癌症治疗相比具有许多优势，包括体内扩增和长期持续性，但仍在进行中。通过引入包括NK细胞在内的CAR工程替代平台，以及测试创新方法(如CRISPR-Cas9基因编辑以抵消肿瘤引发的免疫抑制策略)，目前该疗法的局限性正在被克服。如果这些努力取得成功，我们就可以期待细胞疗法在癌症中的临床应用成为常规而不是一线治疗边缘的研究策略。

内容来源:晨曦 培优创新论坛