新型癌症肿瘤药敏试验-类器官培养——让细胞模型更加"真实"

　　为什么我的细胞实验结果总是和动物实验不太吻合?

　　为什么明明细胞实验效果很好的药物，临床实验却不理想?

　　科研人员常常有这样的困扰，你需要一个更好的模型来协助你的实验。

　　类器官培养的概念最早出现在1987年，当时的科研人员已经设计了三种不同的3D培养的方法，并且利用不同种类的干细胞构建类似器官的类器官。

　　2008年，日本的科研团队证实，干细胞可以被诱导成神经细胞球，并且可以自我组织成层结构。随着对多能干细胞研究的深入，各种各样的类器官系统被建立，当下最热门的肿瘤、胚胎干细胞以及神经等领域的研究，都开始加入类器官培养的元素。

　　目前，最常见的构建类器官模型的方法，用到的细胞是成体干细胞(ASCs)和多能干细胞(PSC)，而PSC由于其具有全能性，更是很好的类器官来源细胞。

　　基于PSC的类器官构建方法，通常从悬浮培养中的细胞聚集开始，形成称为拟胚体(EB)的聚集体。这些聚集体中的细胞，能分化成多种类型的细胞、并且能经历进行自我组织和自我形态建成，继而构建出复杂的细胞模型，可以很好地模拟胞间作用和结构。

　　一些基于PSC的方法需要将细胞封装在天然或合成的细胞外基质(ECM)样底物中。在诱导分化的过程中，需要通过添加生长因子、小分子和其他培养基补充剂来引导类器官系统的形成。但如何合理的选用培养基、试剂或是耗材，也是困扰诸多研究者的一大难题。

　　下面我们通过具体的例子来讲解如何建立神经类器官和球状体。

　　从PSC生成神经类器官的现有工作流程通常遵循特定的步骤序列：从标准PSC培养开始，然后是EB拟胚体的形成、神经诱导、神经模式形成和类器官生长。

　　Phase 1：PSC培养

　　分化前，使用StemFlex培养基培养H9人胚胎干细胞及非整合诱导多能干细胞(episomal iPSCs)，并在涂有Geltrex基底膜基质的 Nunclon™ Delta组织培养皿上生长。

　　Phase 2：构建拟胚体

　　PSC继续在StemFlex培养基中培养，当培养物的融合度达到70-80%时，使用Gibco™ StemPro™ Accutase™细胞解离试剂、胰蛋白酶/EDTA溶液，或TrypLE™ Select解离试剂将它们解离成单细胞悬浮液。

　　在Nunclon Sphera 96孔U型底微孔板中，将活细胞接种在含有Gibco™ RevitaCell™补充剂的StemFlex培养基中。Nunclon Sphera微孔板几乎没有细胞黏附，能够促进形成均一的的类器官。

　　将EB培养3-4天，每隔一天用含有RevitaCell补充剂的StemFlex，更换75%的培养基。得到的EB具有一致的大小，EB大小与接种的细胞数成正比(上图)。

　　Phase 3-4：神经诱导和模式形成

　　在EB形成后，经过连续3-4次75%体积的培养基更换，可逐渐稀释除去先前的培养基，诱导细胞聚集体将逐步分化成神经细胞系。

　　将EB培养8-9天，每隔一天更换75%体积的培养基，直到EB的外层与较暗的中心相比形成明亮的“环”。

　　到第10天，将所有的EB封装在未稀释的Geltrex基底膜基质中，并在37℃孵育成凝胶体。然后将含有EB的Geltrex基质溶液转移至分化培养基中。然后将封装的样品转移至Nunclon Sphera 6孔或24孔板。

　　Phase 5：生长和成熟

　　样品培养在生长和成熟培养基中，该培养基除了添加了B-27补充剂外，与先前的孵育培养基相同。接着，将神经类器官在转式震荡培养箱以80-85rpm的转速培养，并且每2-3天更换培养基。

　　一周内，就能够观察到神经上皮(如下图)。这些样品可以连续培养数周，或直到进行分析(例如，细胞组织、标记物表达)。

　　以上就是一个构建神经细胞类器官的案例。想要了解更多构建适合自己的类器官模型、3D细胞培养和类器官构建的产品及解决方案，请咨询全球肿瘤医生网医学部400-666-7998。