药敏试验,类器官模型预测CAR-T细胞免疫疗法治疗效果

　　责编：文迪

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　　亮点：

　　1、建立了一种可迅速建立病人胶质细胞瘤(类器官)GBOs模型的方法

　　2、类器官保持了原肿瘤的细胞多样性，基因表达和突变侵略性渗透

　　3、GBO可以应用于对药物和CAR-T细胞治疗的反应进行筛查

　　胶质母细胞瘤是成人中最常见的原发性恶性脑肿瘤，死亡率高。针对此疾病的治疗已经进行了许多临床试验，但标准治疗依然是手术切除，随后是temozolomide化疗和放射治疗。即使经过治疗，病人的存活期只有12-14个月。人们越来越认识到肿瘤之间的分子异质性是导致许多临床试验结果不佳的重要原因。鉴定这种异质性并开发新的模型来及时有效地个性化治疗胶质细胞瘤，是临床前和临床上需要解决的主要问题。

　　科研人员已经利用几个模型系统增加了人们目前对胶质细胞瘤生物学机制知识，但是几种模型均有其局限性。传统的体外培养模型，包括单层和肿瘤球状培养，要耗费大量时间来建立，还要添加EGF、bFGF和/或血清来进行癌细胞传代和克隆大量培养，这种方法不利于维持细胞亚型和肿瘤基因表达驱动机制。

　　而原发性肿瘤细胞直接注射到小鼠体内DE异种移植(PDX)模型被认为可以更好地保留胶质细胞瘤的这些重要特征。

　　然而，PDX模型的主要缺点是：

　　1.肿瘤移植效率不稳定,

　　2.宿主细胞对肿瘤的渗透，

　　3.肿瘤生成长时间长(2至11个月)。

　　个性化治疗通常在手术后1个月启动，而诊断后患者的中位存活时间是14.6个月，因此，上述两种模型的时效性阻碍了其临床应用。最近开发的3D类器官培养系统可以捕捉发现各种器官，包括脑器官的表型和分子异质性。

　　类器官已应用于各种癌症研究，包括胰腺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃肠道癌研究。在大多数情况下，上皮来源的肿瘤细胞在添加外源性生长因子的情况下，在基质胶中形成3D结构。各种癌症类器官库被认为是为宝贵的资源。研究胶质细胞瘤时，可以过基因编辑方式使脑器官发展癌症特性，或者和肿瘤球体共孵育来模拟肿瘤细胞的侵袭过程。

　　此外，使用基质胶和外源性 EGF/bFGF 生成的患者胶质细胞瘤类器官，已经被证明具备干细胞异质性和低氧梯度。但是这些类器官捕捉病人肿瘤的关键分子特征的程度尚不清楚。

　　来自美国宾夕法尼亚大学的宋洪军与其团队在Cell上发表文章 A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity。他们发展了一种不需要进行单细胞分离，而利用新鲜肿瘤标本在特别的培养基中快速产生胶质细胞瘤类器官(GBOs)的方法。

　　他们生成了一个实时生物库的 GBO 并综合组织学、分子学和基因组学分析，表明 GBOs 可以重现肿瘤间和肿瘤内异质性并保留其许多相应的关键功能。此外，这些 GBO 可以异种移植进入成年小鼠大脑，快速和侵略性渗透并维持关键突变基因表达。

　　他们进一步表明，在临床相关的时间尺度上，GBO 可用于测试对标准治疗的个体化CAR-T免疫治疗的反应。总之，这些结果凸显胶质母细胞瘤类器官及其基础和转化医学研究生物库，在个体化疗法测试中的潜在效用。

　　他们发展的类器官培养的一个重要特征是：不需要单细胞解离，保留了原生细胞相互作用，不添加外源性EGF/bFGF、血清和细胞外基质的情况下， GBO形成和扩展，此方法有助于 GBO 维持和体内肿瘤相似的特性。这种方法培养出的GBO可在胶质细胞瘤发病机制和治疗方面发挥重要作用。

　　目前癌症组织生物库建立了包括胰腺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、卵巢癌和胃肠道癌，但尚未有胶质母细胞瘤。此项研究提供70 个不同患者 GBO生物库，捕获了主要与胶质细胞瘤发病机制相关的基因组改变。他们优化冷冻和解冻方法，使GBO有效恢复和持续增长，且保持与原肿瘤的相似性，移植到老鼠的GBO可迅速渗透到老鼠大脑。

　　此研究提供了许多生物库GBOs的具体特性，包括组织学，RNA-seq，全外显子测序，以及对不同药物和CAR-T疗法的反应。对于目前进行的肿瘤收集和GBO生成，此生物库将成为未来有用的资源来进行胶质母细胞瘤的生物研究和检测治疗。

　　鉴于大多数胶质细胞瘤患者在诊断后存活期短，确定个性化治疗的时机至关重要，与上述的肿瘤细胞系的不稳定性和PDX模型所需的较长时间相比，建立患者胶质细胞瘤GBO 模所需时间仅为在1-2周，更为可行。此方法提供了一个及时的平台，对于测试单个患者肿瘤个性化治疗策略具有高效性。作者认为，在开始治疗之前，可以利用自多个肿瘤区域的 GBO对几种治疗策略进行有效性测试。另外，GBO移植至动物可以在一个月内快速渗透，及时测试体内治疗反应。

　　虽然GBO诸多方面均与原肿瘤相似，此模型也有其局限性。肿瘤组织采集依赖于与神经外科医生手术时的密切协作，以确保活组织切除时没有被烧焦。与神经病理学的密切协调对于确诊和缩短切除和组织处理之间的时间跨度也很重要，此因素对于 GBO可靠性至关重要。此方法的缺点为，长期维护和扩展 GBO的效果不佳，可能的原因是由于肿瘤本身组织的质量，组织的多样性和生长特征不同所致。

　　为了保持其更具侵略性的增长表型，绝大多数情况下(96.4%)采用 IDH1-WT肿瘤用来培养GBO，但我们在IDH1突变肿瘤的研究现实显示成功率降低(66.7%和 75.0%)。可能需要进一步优化现有方法来更有效地建立其他脑瘤类器官模型。初始肿瘤体积和GBO的生长率对于深入研究具有挑战性，但是基本表征和测试靶向疗法所需组织通常比较充足。

　　此研究发现微血管和免疫细胞在一些GBO的保留，有助于更好地理解肿瘤微环境。然而，随着时间的推移，与原发性肿瘤相比，GBO血管和巨噬细胞/微胶的丰度降低，免疫相关基因的低表达，是因为培养条件保持肿瘤细胞的生存能力和生长，而免疫细胞的寿命有限，并逐渐被稀释，因此，对于免疫微环境的研究应在 GBO 建立后或者外源性免疫细胞重组后尽早进行。鉴于GBO 中不同的细胞群扩散和死亡，其细胞类型的组成也会随之转变，因此建立 GBO应尽快进行分析。

　　此研究获得活胶质细胞瘤组织并持续培养，为研究原肿瘤提供了一个独特的方式。今后，可结合RNA-seq和生物信息学方法推断谱系轨迹相结合，使用病毒条码标签跟踪特定细胞的分裂行为和克隆GBO 中的子类型。此系统还通过CRISPR-Cas9基因编辑方法，siRNA敲除，和载体过表达等方法研究胶质细胞瘤发病机制。

　　体内测试之前， 3D GBO 模型为测试和优化体外实体肿瘤的CAR-T疗法提供了平台，并可发展成新的治疗策略。更重要的是，GBO 概括了抗原的表达，可以更准确评估CAR-T细胞疗法的反应，响应阈值，特异性。治疗测试可以扩展到GBO异种移植模型，重现肿瘤渗透进入周围脑组织的过程。在治疗药物耐受及复发性肿瘤方面，此研究提供了药物影响、免疫疗法和/或GBO放射治疗，肿瘤组成和再生能力方面的数据。

　　总之，患者衍生的GBO模型概括了胶质母细胞瘤的异质性和主要特征，具有及时测试个性化治疗的潜力，同时在研究胶质母细胞瘤翻译方式的基础研究方向也具有广泛应用。

　　教授介绍

　　宋洪军教授就职于霍普金斯大学，实验室的研究侧重于了解调节哺乳动物大脑中神经干细胞和神经发生的机制。该团队以神经干细胞为工具，探索精神障碍背后的分子机制，旨在开发治疗退行性神经系统疾病的新策略。研究人员使用分子生物学、生物化学、表观遗传学、基因组学、小鼠遗传学、免疫细胞化学和免疫组织学、电子显微镜、电生理学和动物行为学的综合方法。

　　宋博士和他的同事对了解啮齿动物模型中的成人神经发生过程做出了重大贡献，包括将径向胶质像前体作为一种自我更新和多能的成人神经干细胞的示范及其由神经元活动调节。宋博士和他的实验室也为理解成人大脑中的表观遗传DNA修饰做出了重大贡献，并建立了高通量测序分析的管线，包括RNA-seq、芯片-seq和Bisulfite-seq内置所有生物信息分析。

　　该小组还利用成人神经发生作为体内实验模型系统，以解决风险基因对神经发育中精神障碍的作用。在过去的10年里，他们专注于一个基因，名为精神分裂症1(DISC1)。宋博士和他的团队已经确定了DISC1在调节成年海马神经发生的不同方面的多重作用，包括神经元形态发生、斧头靶向和树突发育，并提供了第一个实验证据，支持DISC1在调节体内突触形成中的关键作用。

　　他们还把他们在DISC1信号的基本发现从动物模型转换到人类。例如，与丹尼·温伯格的实验室合作，显示DISC1和GABA信号之间的相互作用，他们发现，调节小鼠的成年神经发生，也影响人类组群精神分裂症的风险基于人类fMRI研究的基因分析，影响人类海马连通性和功能。

　　在过去的六年里，宋博士还一直使用患者衍生的iPSC作为了解精神障碍和神经系统疾病机制的模型。他和他的同事发表了第一份关于来自患者H的iPSC线的报告。在过去的四年中，他们从Pedigree H生成了额外的iPSC线，更重要的是，通过基因编辑生成了多个同源线。

　　除了DISC1研究外，宋博士的实验室还帮助霍普金斯大学的其他同事进行iPSC研究，并针对不同疾病生成了100多条iPSC线。他们还参与了大型合作研究财团，如亨廷顿舞蹈症iPSC联盟。宋博士曾指导过多位研究生、博士后研究员、临床研究员和本科生。

　　该实验室的研究生和博士后研究员获得了NIH(F31和K99)和私人基金会的奖学金。宋博士的两名研究生分别获得哈罗德·温特劳布研究生奖和彼得奖(2009年、2011年)和帕特里夏·格鲁伯神经科学国际研究奖(2012年、2013年)。他还共同指导了K08、K03和R25的临床研究员奖，他以前的7名学员现在是不同大学的助理教授。

　　文中提到胶质母细胞瘤，经过大数据分析，与MGMT、EGFR和PTEN等基因相关(相关条目按富集度排序)

　　参考文献

　　1. Fadi Jacob，Ryan D. Salinas, Daniel Y. Zhang et al. APatient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter-and Intra-tumoral Heterogeneity. Cell 180, 1–17, 2020.

　　文章来源:文迪 图灵基因